Share |
يوليو 2011
5
دراسات بيوكيماوية علي النواتج الثانوية لحفظ الأصول الوراثية لنباتات السموة والونكا
المصدر: المجلة الزراعية


يوجد العديد من النباتات الطبية والعطرية المستخدمة في علاج انواع مختلفة من الأمراض المزمنة والتي منها الأمراض البكتيرية والفيروسية والفسيولوجية والمناعية وغيرها، وذلك لما تحتويه من مواد فعالة ومكونات طبيعية مثل الفلافونويدات والتربينات والقلويدات والتانينات وغيرها.
ويعتبر نبات الونكا من النباتات الغنية بالمركبات الثانوية مثل الفينبلاستين Vinblastine والفينكريستين Vincristine التي تستخدم في علاج العديد من الأمراض منها أمراض السرطان وعلي الأخص مرض سرطان الدم بأنواعه، كذلك السموه تحتوي علي مركبات الفلافونويد Flvonoids بأنواعها المختلفة التي تدخل في العديد من صناعة الأدوية الخاصة بخفض نسبة السكر بالدم، وعلاج الالتهابات ومستحضرات التجميل وغيرها،وتوجد هذه المركبات بكميات ضئيلة جدا غير ملحوظة في الأجزاء النباتية المختلفة، وفي هذه الدراسة استخدمت تجارب مختلفة بهدف التوصل إلي اكثر الطرق زيادة في انتاج المواد الفعالة مع الاحتفاظ بالتأثير البيولوجي لها دون حدوث تغيرات كيماوية.
لذلك اجريت هذه الدراسة علي أربع مجموعات من الأبحاث خلال الفترة من 2003 إلي 2010 بمعمل بحوث زراعة الأنسجة وحفظ الأصول الوراثية، معهد بحوث البساتين مركز البحوث الزراعية بالتعاون مع قسم الكيمياء الحيوية كلية الزراعة جامعة القاهرة.
وكانت أهداف الدراسة هي:
1- دراسة تأثير بعض المعاملات الكيماوية (أحماض أمينية سكريات ومواد اسموزية مركبات فينولية منظمات نمو مثبطات نمو) علي صفات النمو المورفولوجية للفصلات النباتية والكالس لنباتات الونكا والسموة.
2- دراسة تأثير بعض المعاملات الفيزيائية (التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية الموجات الكهرومغناطيسية درجات الحرارة المنخفضة 4م الإظلام) علي صفات النمو المورفولوجية للفصلات النباتية والكالس لنباتات الونكا والسموة.
3- دراسة تأثير كل من العوامل الكيماوية والفيزيائية علي المحتوي الكيماوي (صبغات الإندولات الفينولات الكربوهيدرات) للفصلات النباتية والكالس لنباتات الونكا والسموة.
4- دراسة تأثير كلا من العوامل الكيماوية والفيزيائية علي المواد الفعالة (VinblastineVincristine وFlavonoids).
5- التعرف علي المحتوي الأنزيمي لأنزيمات البولي فينوليز والبيروكسيديز بالتفريد الكهربي Electrophoresis وكذلك التفريد الكهربي لDNA بواسطة الRAPD لدراسة الثبات الوراثي للمعاملات الحفظ.
6- دراسة التأثير البيولوجي الVincristine وVinblastine الناتج من التجارب السابقة لنباتات الونكا علي سرطان الدم الميلودي المزمن وFlavonoid الناتج من تجارب السموة علي البكتيريا الممرضة.
1- السموة Cleome droserifolia
- الإكثار الدقيق
- تأثير مرحلة الأساس علي:
- نسبة التعقيم (عدم التلوث)
اكثر طرق التعقيم تأثيرا كانت استخدام هيبوكلوريت الصوديوم (كلوروكس) بتركيز 15% لمدة عشر دقائق حيث زادت نسبة عدم التلوث إلي أعلي نسبة مقارنة بباقي المعاملات.
ب- نسبة الأنبات:
المعاملة بالزياتين بتركيز 15 ملجم/ لتر في بيئة موراشيج وسكوج منفردا ادي إلي زيادة نسبة انبات البذرة إلي أعلي قيمة بالمقارنة بالكنترول وباقي المعاملات.
ح- نسبة البقاء وتفتح البراعم
استخدم كلا من البنزيل ادنين والكينيتين والجبرالين والزياتين لدراسة النمو، حيث ازدادت نسبة البقاء إلي أعلي درجة عند استخدام الزياتين بتركيز 15 ملجم/ لتر بالمقارنة بالكنترول، اما تفتح البراعم فلم يتأثر معنويا نتيجة بالمعاملة بالمعاملات السابقة.
2- تأثير مرحلة الزيادة العددية
أ- تأثير منظمات النمو
أكبر عدد من الفريعات المتكونة نتج من استخدام BAP بتركيز (0.25 ملجم/ لتر) مضافا مع الكينيتين بتركيز ( 0.5ملجم/ لتر) في وجود الفحم النشط خلال دورة النمو الأولي مقارنة بباقي المعاملات، اما عدد الفريعات زاد إلي اكبر عدد في وجود الفحم النشط علي بيئة محتوية علي BAP (0.5 ملجم/ لتر) خلال دورة النمو الثانية.
أدي استخدام BAPبتركيز 0.25ملجم/لتر مضافا مع الكينيتين بتركيز (0.5ملجم/لتر) مع الفحم النشط إلي زيادة في ارتفاع الأفرع إلي أكبر طول وذلك في دورتي النمو مقارنة بباقي المعاملات.
كان لاستخدام الBAP بتركيز 0.25 ملجم/لتر مضافا مع الكينيتين بتركيز (0.5 ملجم/ لتر) مع الفحم النشط خلال دورة النمو الثانية أعلي تأثير في زيادة عدد الأوراق لكل نوع.
أدي استخدام الفحم النشط إلي تكوين اكبر نسبة من الجذور مع اضافة BAP بتركيز 0.25 ملجم/ لتر مضافا مع الكينيتين بتركيز (0.5ملجم/لتر) اما في حالة عدم وجود الفحم النشط لم تتكون اي جذور.
ب- تأثير الأحماض الأمينية
أدي استخدام الأحماض الأمينية بتركيزات 100، 50 جزء في المليون إلي عدم وجود فارق معنوي في عدد الأفرع المتكونة.
أدي استخدام الحمض الأميني البرولين 100 جزء في المليون ادي إلي زيادة في طول النباتات وعدد الأوراق المتكونة علي كل فرع مقارنة بباقي المعاملات والكنترول.
لم تتكون اي جذور علي الأفرع نتيجة للمعاملة بالأحماض الأمينية.
ح تأثير المظهرات
أدي استخدام مركبات الكاتيكول او حمض الكافييك بتركيزات 10 أو 15 مجم/ لتر منفردة إلي زيادة عدد الأفرع المتكونة لكل فصلة نباتية مقارنة بباقي المعاملات.
زاد طول الأفرع إلي الأقصي ارتفاع نتيجة المعاملة بالكاتيكول بتركيز 10 إلي 15 مجم/ لتر مقارنة بباقي المعاملات، مما أدي إلي زيادة عدد الأوراق نتيجة للمعاملة بنفس المادة بنفس التركيزات.
د تأثير التشعيع
كان لتعريض الفصلات النباتية إلي الأشعة فوق البنفسجية لمدة 6 ساعات سبب في زيادة التفريع بالمقارنة بباقي المعاملات، وكذلك زيادة طول الفريعات المتكونة نتيجة لتلك المعاملة، بينما ازداد عدد الأوراق إلي اقصي عدد عند التعريض إلي الميكروويف بقدرة 65 وات لمدة دقيقة واحدة.
ه تأثير معاملات الحفظ
الحفظ بالسوربيتول بتركيز 1.0 أو 1.5 جم/ لتر اعطي أفضل عدد للأفرع وعدد للأوراق المتكونة علي كل فرع من الأفرع المتكونة للنباتات خلال فترة الحفظ في حين كانت البرودة علي درجة 4 م والاظلام أقل عدد افرع.
استخدام البولي اثيلين جليكول بتركيز 1.0 جم/لتر زاد من ارتفاع النباتات المتكونة خلال فترة الحفظ، بينما البرودة والإظلام كان له تأثير ايجابي حيث قلل نمو الأفرع إلي اقل طول وأقل عدد اوراق.
ح- تأثير النمو بعد الحفظ
كان لاستخدام الكيومارين في الحفظ بتركيزات 1.0 أو 1.5 مجم/ لتر تأثير ايجابي علي النمو حيث حققت المعاملات افضل نمو بعد الحفظ مقارنة بباقي المعاملات والكنترول.
ب- إنتاج الكالس
1- تأثير نوع الجزء النباتي ومنظمات النمو
افضل النتائج كان للجزء المأخوذ من الساق حيث أعطت كل المعاملات كالس ما عدا الكنترول، كذلك الورقة اعطت كل المعاملات كالس ولم تعط فارقا معنويا ماعدا استخدام D -4.2 بتركيز 1.5 أو 1.0 مجم / لتر NAA بتركيز 1.5 مجم/ لتر مضافا مع 2.40 بتركيز 1.0 مجم / لتر.
كما ادي استخدام جزء من الساق إلي تكوين اكبر حجم من الكالس في معاملات منظمات النمو، وكان اللون الغالب للكالس الناتج من الساق والأوراق هو الأخضر أو الأخضر الباهت، اما الجذور فأعطت لونا اصفر.
2- تأثير الفحم النشط وعدد مرات النقل ومنظمات النمو
في دورة النمو الأول في حالة غياب الفحم النشط البنزيل أدنين بتركيز 0.25 والأندول بتركيز 0.5 والكينتين بتركيز 0.5 مجم/ لتر أعطي أعلي نسبة تكوين كالس أما في حالة إضافة الفحم فإن البنزيل وحدة أو بتركيز 0.25 و0.5 مجم/ لتر مع الكينيتين 0.25 و0.5 مجم / لتر اعطي افضل كمية كالس.
3- تأثير الأحماض الأمينية
اعطت المعاملة بالأحماض الأمينية تأثيرا ايجابيا في تكوين الكالس حيث أعطت كل المعاملات اعلي نسبة في تكوين الكالس، بينما تفوق كل من السيستين 50 جزءاً في المليون، التيروزين 50 جزءا في المليون، والاسبراجين 100 جزء في الميلون علي باقي المعاملات في كمية الكالس المتكونة.
زاد كل من قطر وارتفاع الكالس عند المعاملة بالأسبراجين 100 جزء في المليون والتيروزين 50 جزءا في المليون علي التوالي.
4- تأثير التشعيع
ادي تعريض الفصلة النباتية للتشعيع إلي تأثير سلبي علي تكوين الكالس حيث كان التأثير مثبطا لتكوين الكالس ماعدا التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 4 ساعات اعطي نسبة منخفضة من الكالس.
5- تأثير معاملات الحفظ
الحفظ باستخدام البولي إثيلين جليكول بتركيز 1جم/ لتر وكذلك الكومارين بتركيز 1.5 مجم/ لتر اعطي اعلي نسبة تكوين كالس مقارنة بباقي المعاملات، في حين كانت الفروق بين كل المعاملات غير معنوية من حيث كمية الكالس المتكون ماعدا المعاملة بالبولي اثيلينن جليكول بتركيز 0.5 جم/لتر.
أما بالنسبة لأبعاد الكالس فكان الكومارين بتركيز 1.0و1.5 مجم/ لتر اكثر تأثيرا علي زيادة ارتفاع وقطر الكالس علي التوالي.
ح المحتوي الكيميائي
1- المحتوي الكيماوي للفصلة النباتية
أ- تأثير منظمات النمو والفحم النشط
الصبغات: زاد محتوي النبات من الصبغات (كلورفيل 1، كلورفيل ب والكاروتين) في وجود الفحم النشط مع المعاملة بالبنزيل 0.5+ كينيتين 0.5 مجم/ لتر وذلك في دورة النمو الثانية مقارنة بباقي المعاملات.
الإندولات: أدي استخدام البنزيل ادنين بتركيز 0.5 مجم/ لتر + كينيتين بتركيز 0.25 مجم/لتر إلي زيادة معنوية في نسبة الإندولات الكلية الذائبة بينما الفحم النشط لم يؤثر علي هذه الكمية.
الفينولات: زادت نسبة الفينولات الكلية الذائبة إلي أعلي قيمة لها عند المعاملة بالكينيتين بتركيز 0.5 مجم/ لتر + إندول بيوتريك أسيد بتركيز 0.5 مجم / لتر في غياب الفحم النشط.
الكربوهيدرات: كان لإستخدام الكينيتين بتركيز 0.25 مجم/لتر + إندول بيوتريك أسيد بتركيز 0.25 مجم/ لتر تأثير إيجابي علي كمية الكربوهيدرات الكلية وذلك في وجود الفحم النشط.
ب- تأثير الأحماض الأمينية
الصبغات: تأثرت صبغات البناء الضوئي (كلوروفيل 1، كلوروفيل ب والكاروتين) تأثرا إيجابيا نتيجة المعاملة بالحمض الأميني جلوتامين بتركيز 100 جزء في المليون حيث اعطي علي قيمه.
الإندولات: حقق الحمض الأميني برولين بتركيز 50 جزء في المليون آعلي كمية من الإندولات الكلية مقارنة بباقي المعاملات.
الفينولات: تأثرت كمية الفينولات الكلية الذائية بالمعاملة بالأحماض الأمينيه برولين بتركيز 100 جزء في المليون، السيستين بتركيز 100 جزء في المليون والتربتوفان 50 جزءا في المليون تأثرا ايجابيا حيث اعطت اعلي قيمة.
الكربوهيدرات: إزدادت كمية الكربوهيدرات الكلية إلي أعلي قيمة لها نتيجة للمعاملة بالحمض الأميني جلوتامين بتركيز 50 جزءاً في المليون.
ت- تأثير المظهرات
الصبغات: تفوق الكاتيكول بتركيز 15 مجم / لتر كمادة مظهرة علي باقي المعاملات حيث ادي إلي زيادة معنوية في كمية الصبغات الناتجة من البناء الضوئي (كلوروفيل 1، كلوروفيل ب والكاروتين).
الإندولات: إرتفعت نسب الإندولات الكلية نتيجة لمعاملة الفصلة النباتية بالكاتيكول بتركيز 15 مجم/لتر إلي أعلي قيمة لها بالمقارنة بالمظهرات الأخري والكنترول.
الفينولات: حقق الكافيين بتركيز 10 مجم/ لتر اعلي قيمة من الفينولات الذائبة بينما باقي المعاملات لم يكن بينها فارق معنوي.
الكربوهيدرات: نسبة الكربوهيدرات الكلية حققت أعلي قيمة لها نتيجة لمعاملة الفصلة النباتية بالكاتيكول 15 مجم/ لتر.
تأثير التشعيع
الصبغات: تأثرت صبغات البناء الضوئي (كلورفيل 1، كلوروفيل ب والكاروتين) بتعريض الفصله النباتية إلي الأشعة فوق بنفسجية لمدة ساعتين مقارنة بباقي المعاملات.
الإندولات: حقق تعريض الفصلة النباتية للأشعة فوق البنفسجية لمده اربع او ست ساعات تأثيرا معنويا علي كمية الإندولات الكلية المتكونة مقترنة بباقي المعاملات.
الفينولات: تأثرت كمية الفينولات الكلية بالمعاملة بالأشعة فوق البنفسجية لمدة اربع ساعات تأثرا ايجابيا حيث اعطت اعلي قيمة لها بالمقارنة بباقي المعاملات.
الكربوهيدرات: إزدادت كمية الكربوهيدرات الكلية إلي أعلي قيمة لها في النباتات غير المعاملة (الكنترول) بينما اثرت كل معاملات التشعيع تاثيرا سلبيا علي الكربوهيدرات الكلية ج تأثير معاملات الحفظ
الصبغات: تفوق الكومارين بتركيز 0.5 مجم/ لتر كمادة حفظ (مثبطات نمو) علي باقي المعاملات حيث ادي إلي زيادة معنوية في كمية الصبغات الناتجة من البناء الضوئي (كلوروفيل 1، كلوروفيل ب والكاروتين) مقارنة بباقي المعاملات.
الإندولات: ارتفعت نسبة الاندولات الكلية نتيجة لمعاملة الفصلة النباتية بالسوربيتول بتركيز 1 جم /لتر كمادة حفظ (مواد اسموزية) إلي أعلي قيمة لها بالمقارنة بطرق الحفظ الأخري والكنترول.
الفينولات: ازدادت نسبة الفينولات الذائبة الكلية عند حفظ الفصلة النباتية علي درجة حرارة منخفضة (4م) والإظلام مقارنة بباقي المعاملات.
الكربوهيدرات: نسبة الكربوهيدرات الكلية حققت أعلي قيمة لها نتيجة لحفظ الفصلة النباتية بالسوربيتول 0.5 جم لتر.
2- المحتوي الكيماوي للكالس
أ- تأثير الأحماض الأمنية
الاندولات: عند معاملة الكالس بالأحماض الأمينية، حقق الحمض الأميني سيستين بتركيز 50 جزءا في المليون أعلي كمية من الاندولات الكلية مقارنة بباقي المعاملات.
الفينولات: تأثرت كمية الفينولات الكلية الذائبة بالمعاملة بالأحماض الأمينية تأثيرا معنويا، حيث اثر البرولين بتركيز 50 جزءا في المليون تأثيرا ايجابيا علي كمية الفينولات حيث اعطت اعلي قيم.
الكربوهيدرات: ازدادت كمية الكربوهيدرات الكلية إلي أعلي قيمة لها نتيجة للمعاملة بالحمض الأميني برولين بتركيز 50 جزءا في المليون.
ب- تأثير التشعيع
الاندولات: حقق تعريض الكالس للميكروويف بقدرة 195 وات لمدة دقيقة تأثيرا معنويا علي كمية الاندولات الكلية المتكونة مقارنة بباقي المعاملات.
الفينولات: تأثرت كمية الفينولات الكلية الذائبة بالمعاملة بالموجات الكهرومغناطيسية (الميكروويف) بقدرة 65 وات لمدة دقيقة، الاشعة فوق البنفسجية لمدة ساعتين وأربع ساعات تأثرا ايجابيا حيث اعطت أعلي قيم لها بالمقارنة بباقي المعاملات.
الكربوهيدرات: ازدادت كمية الكربوهيدرات الكلية إلي أعلي قيم لها في الكالس غير المعاملة (الكنترول) والميكروويف بقدرة 350 و195 وات لمدة دقيقة بينما أثرت كل معاملات التشعيع تأثيرا سلبيا علي الكربوهيدرات.
ت- تأثير الحفظ
الاندولات: ارتفعت نسبة الاندولات الكلية نتيجة لحفظ الكالس بالكومارين بتركيز 1.5 مجم /لتر كمادة حفظ (مثبطات نمو) أو بولي اثيلين جليكول بتركيز 1.5 جم /لتر إلي أعلي قيمة لها بالمقارنة بطرق الحفظ الأخري والكنترول.
الفينولات: ازدادت نسبة الفينولات الذائبة الكلية عند حفظ الكالس بالبولي اثيلين جليكول بتركيز 1.5 جم /لتر مقارنة بباقي المعاملات.
الكربوهيدرات: نسبة الكربوهيدرات الكلية حققت أعلي قيمة لها نتيجة حفظ الكالس بالبولي اثيلين جليكول بتركيز 1.5 جم /لتر مقارنة بباقي المعاملات
3- محتوي الكالس والفصلة النباتية من الفلافونويد
أعطي جهاز الفصل الكروماتوجرافي أعلي قيمة لنسبة الفلافونويد الكلية في الفصلة النباتية المعاملة بالحمض الأميني البرولين بتركيز 100 جزء في المليون وكذلك الفصلات المشعشعة بالاشعة فوق البنفسجية لمدة 4 ساعات مقارنة بالكنترول.
كما أعطي الكالس المعامل بالموجات الكهرومغناطيسية (الميكروويف) بقدرة 65 وات أعلي قيمة من الفلافونويد الكلية، يليه المعاملة بالحمض الأميني برولين بتركيز 50 جزءاً في المليون ثم التشعيع بالاشعة فوق البنفسجية لمدة ساعتين.
ث- التقييم البيولوجي والوراثي
1- التحليل الكهربي للمشابهات الانزيمية
أ- البيروكسيديز
لم تظهر أي اختلافات للمشابهات الانزيمية سواء غياب أو وجود البند من (1) إلي (6) وذلك للنباتات المعاملة بالسوربيتول بتركيز 1.5 جم /لتر مقارنة بالكنترول وباقي المعاملات.
ب- البولي فينول أوكسيديز
أظهرت المعاملة بالسوربيتول بتركيز 1.5 جم/لتر عدم وجود اختلافات في البند من (1) إلي (3) مقارنة بالكنترول والبولي إثيلين جليكول بتركيز 1.0 جم/لتر.
2- تفاعل البلمرة المتسلسل (RAPD _PCR)
أظهرت تفاعلات البلمرة المتسلسلة (RAPD_PCR) وجود نسبة بسيطة من الاختلافات الوراثية 27068% خاصة عند استخدام البرايمر op-B21,op-c10 مقارنة بop-L31 وop-M10 التي لم تعط أي اختلافات في البند.
3- التقييم البيولوجي
أ- تعريف الميكروب
أظهر الصبغ بجرام وبعض التفاعلات البيوكيماوية (تفاعل اليورييز، الاندول، السكريات الثلاثية) وجود ثلاثة أنواع من البكتيريا العصوية السالبة لجرام وهي:
proteus mirabilis, pseudomonas aeruginos and klebsiella spp
ب- تفاعلات أقل تركيز مثبط للبكتيريا (MIC)
proteus mirabilis: أظهر المستخلص الميثانولي أقل تركيز مثبط لنمو البكتيريا عند تركيز 1.6 ميكروجرام/مل وذلك لمستخلص الميثانول للفصلة النباتية غير المعاملة (الكنترول).
Pseudomonas aeruginos and klebsiella spp : أظهر المستخلص الميثانولي أقل تركيز مثبط لنمو البكتيريا عند تركيز 5.32 ميكروجرام/ مل وذلك لمستخلص الميثانول للفصلة النباتية المعامل بالميكروويف بقدرة 195 وات.